公开(公告)号：CN108587997B

公开(公告)日：2021-03-02

申请号：CN201810447027.3

申请日：2018-05-11

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  沙宗焱 ,  哈婧雯 ,  燕宇 ,  刘昭君 ,  樊佳慧 ,  高梦昕 ,  邵明龙 ,  张显

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/77 ,  C12N15/53 ,  C12P33/06 ,  C12R1/15

Abstract: 本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9‑OH‑AD的方法，属于生物工程和生物技术领域。本发明通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮，底物雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮具有效率高，专一性强,能耗低等优点。

公开(公告)号：CN108587997A

公开(公告)日：2018-09-28

申请号：CN201810447027.3

申请日：2018-05-11

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  沙宗焱 ,  哈婧雯 ,  燕宇 ,  刘昭君 ,  樊佳慧 ,  高梦昕 ,  邵明龙 ,  张显

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/77 ,  C12N15/53 ,  C12P33/06 ,  C12R1/15

Abstract: 本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-OH-AD的方法，属于生物工程和生物技术领域。本发明通过大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB成功在C.glutamicum ATCC13032中共表达。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，底物雄甾-4-烯-3,17-二酮的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮具有效率高，专一性强,能耗低等优点。

公开(公告)号：CN107955827A

公开(公告)日：2018-04-24

申请号：CN201711352434.8

申请日：2017-12-15

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  沙宗焱 ,  张显 ,  杨套伟 ,  徐美娟

IPC: C12P33/06 ,  C12N9/02 ,  C12N15/70

CPC classification number: C12N9/0073 ,  C12N15/70 ,  C12P33/06 ,  C12Y114/13142

Abstract: 本发明公开了一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc-1817D的3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB，及未知活性亚基KshC成功在E.coliBL21中表达，并鉴定出KshC为氧化亚基，且酶活远高于KshA。利用本实验室已构建的BL21/pET-28a(+)-fdh表达甲酸脱氢酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以甾体化合物AD为底物，同时确定了最佳反应温度为30℃，pH7.0。在最优条件下转化AD生成产物9-OH-AD，在20小时内，9-OH-AD的产量为4.7g/L，摩尔转化率达到96.7％。本发明产生9-OH-AD实现了3-甾酮9α-羟基化酶羟化系统与辅酶循环体系的偶联，具有效率高，成本低，绿色环保等优点。

公开(公告)号：CN106636160A

公开(公告)日：2017-05-10

申请号：CN201611010801.1

申请日：2016-11-17

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  邵明龙 ,  沙宗焱 ,  张显 ,  杨套伟 ,  徐美娟 ,  许正宏

IPC: C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P33/02 ,  C12R1/19

CPC classification number: C12N15/70 ,  C12N9/0073 ,  C12N2800/101 ,  C12P33/02 ,  C12Y114/13054

Abstract: 一种利用重组Escherichia coli全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶(KSDD)的基因扩增，然后利用pET28a质粒，实现了该基因在模式菌株大肠杆菌BL21中的过量表达。本发明构建以4‑AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的大肠杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％(w/v)4‑AD为底物，全细胞转化10h，底物摩尔转化率达到76.5％，是出发菌株相对转化率的25倍。本发明为微生物一步发酵法生产ADD的工业化提供了有益的指导。

公开(公告)号：CN107955827B

公开(公告)日：2019-07-02

申请号：CN201711352434.8

申请日：2017-12-15

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  沙宗焱 ,  张显 ,  杨套伟 ,  徐美娟

IPC: C12P33/06 ,  C12N9/02 ,  C12N15/70

CPC classification number: C12N9/0073 ,  C12N15/70 ,  C12P33/06 ,  C12Y114/13142

Abstract: 本发明公开了一种酶法转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB，及未知活性亚基KshC成功在E.coliBL21中表达，并鉴定出KshC为氧化亚基，且酶活远高于KshA。利用本实验室已构建的BL21/pET‑28a(+)‑fdh表达甲酸脱氢酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以甾体化合物AD为底物，同时确定了最佳反应温度为30℃，pH7.0。在最优条件下转化AD生成产物9‑OH‑AD，在20小时内，9‑OH‑AD的产量为4.7g/L，摩尔转化率达到96.7％。本发明产生9‑OH‑AD实现了3‑甾酮9α‑羟基化酶羟化系统与辅酶循环体系的偶联，具有效率高，成本低，绿色环保等优点。

公开(公告)号：CN106566816A

公开(公告)日：2017-04-19

申请号：CN201611010784.1

申请日：2016-11-17

Applicant: 江南大学

Inventor： 饶志明 ,  邵明龙 ,  沙宗焱 ,  张显 ,  杨套伟 ,  徐美娟

IPC: C12N9/02 ,  C12N1/21 ,  C12N15/75 ,  C12R1/125

CPC classification number: C12N15/75 ,  C12N9/0073 ,  C12N2800/101 ,  C12Y114/13054

Abstract: 本发明公开了一种酶活提高的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第366位缬氨酸突变成丝氨酸。本发明得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，摇瓶发酵24h后酶活为2.15U/mL，突变酶活提高了23％，底物亲和力较原始酶提高67％，催化效率提高43％，同时比酶活提高176％。本发明表明366位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。