公开(公告)号：CN116103215A

公开(公告)日：2023-05-12

申请号：CN202310210617.5

申请日：2023-03-07

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  李雪峰 ,  周俊平 ,  徐建妙 ,  张博 ,  黄良刚 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/60 ,  C12N15/70 ,  C12P13/04 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种高产L‑2‑氨基丁酸的无质粒基因工程菌及其应用。本发明提供的产L‑2‑氨基丁酸的无质粒基因工程菌，以Escherichia coli THR为底盘细胞经代谢工程和基因编辑技术改造得到，该基因工程菌菌株能以葡萄糖为原料，通过发酵培养得到L‑2‑氨基丁酸，在无质粒增加外源酶活的情况下，5L发酵罐分批补料发酵产量达到13.81g/L，发酵成本低，产物浓度高，没有副产物影响，产物易于纯化，适用于工业应用。

公开(公告)号：CN116064354A

公开(公告)日：2023-05-05

申请号：CN202211335028.1

申请日：2022-10-28

申请人： 浙江工业大学

发明人： 张博 ,  杨辉 ,  吴梓丹 ,  陈立峰 ,  潘佳园 ,  柳志强 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/90 ,  C12N15/67 ,  C12N15/31 ,  C12P13/12 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过构建能够响应细胞内L‑半胱氨酸的DECR‑CYS动态调控系统，利用不同的工程启动子，驱动通过筛选得到的有效的L‑半胱氨酸转运蛋白YdeD，YfiK，YeaS，AlaE和TolC组建成的高效的L‑半胱氨酸转运系统，获得高产L‑半胱氨酸的大肠杆菌工程菌株。本发明所构建的工程菌株，能够响应L‑半胱氨酸的积累水平，动态地激活L‑半胱氨酸转运系统，降低L‑半胱氨酸对细胞的毒性影响，具有较好的生产应用价值。

公开(公告)号：CN113462630B

公开(公告)日：2023-05-05

申请号：CN202110839660.9

申请日：2021-07-23

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  强煜 ,  蔡雪 ,  刘思琦 ,  张博 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/54 ,  C12P13/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高产泛酸基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备泛酸中的应用。本发明通过突变其基因组中panB基因的关键位点来加强panB基因的表达，有利于提高生物发酵法生产泛酸的效率。本发明得到了一系列对泛酸产率有明显改变的酮泛解酸羟甲基转移酶突变基因工程菌，所得酮泛解酸羟甲基转移酶突变基因工程菌用于发酵法生产D‑泛酸，相较原始基因工程菌株，本发明构建的酮泛解酸羟甲基转移酶突变基因工程菌通过发酵生产D‑泛酸的产率有所提高，具有工业化开发应用前景。

公开(公告)号：CN112779203B

公开(公告)日：2022-12-30

申请号：CN202110066393.6

申请日：2021-01-19

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  黄子瀚 ,  张博 ,  陈开 ,  杨辉 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/113 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12P13/12 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径中S‑Sulfocysteine转化为L‑半胱氨酸的效率(2)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径中硫代硫酸根的利用率得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸的产量从3.90g/L提升到了4.88g/L。

公开(公告)号：CN115058401A

公开(公告)日：2022-09-16

申请号：CN202210727421.9

申请日：2022-06-24

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  蔡雪 ,  刘思琦 ,  施雪 ,  金利群 ,  张博 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N9/10 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P13/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种酮泛解酸羟甲基转移酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌及应用。所述突变体是利用基因工程技术对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)来源的酮泛解酸羟甲基转移酶KPHMT基因进行定点突变，后导入表达宿主E.coli BL21(DE3)中得到。本发明的有益效果主要体现在：本发明得到了一系列对酮泛解酸羟甲基转移酶酶活有明显改变的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体，相较野生型酮泛解酸羟甲基转移酶，本发明构建的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体通过与野生型酶比较，酶活有所提高，优于现有报道的酮泛解酸羟甲基转移酶，可有效提高终产物D‑泛酸的产量，降低生产成本。

公开(公告)号：CN112063572B

公开(公告)日：2022-07-19

申请号：CN202011002103.3

申请日：2020-09-22

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  刘鹏 ,  张博 ,  牛坤 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/90 ,  C12N15/67 ,  C12N15/54 ,  C12N15/53 ,  C12P13/06 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种高产O‑乙酰‑L‑高丝氨酸重组大肠杆菌，及在微生物发酵制备O‑乙酰‑L‑高丝氨酸中的应用。本发明首先通过敲除甘油代谢途径中负责编码阻遏蛋白的基因glpR，使得甘油激酶基因glpK和甘油3‑磷酸脱氢酶基因的组成型表达，以增强菌株甘油代谢途径的通量；其次通过过表达glpD基因发现该基因为菌株甘油代谢途径中的关键基因；最后通过trc启动子替换glpD基因的原位启动子表明菌株发酵产O‑乙酰‑L高丝氨酸的水平与glpD基因的表达水平密切相关。通过以上改造策略的组合，获得了高产O‑乙酰‑L‑高丝氨酸的大肠杆菌菌株。

公开(公告)号：CN113278569B

公开(公告)日：2022-04-19

申请号：CN202110512009.0

申请日：2021-05-11

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  张博 ,  陈力 ,  金洁漪 ,  李波 ,  王培 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12N15/113 ,  C12P13/02 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了阻断，减少有机酸的副作用及增加丙酮酸池的积累，加强丙酮酸合成途径基因pykA，加强丙酮酸积累，解除关键酶的负反馈抑制，解决D‑泛酸合成的瓶颈步骤，改善糖摄取能力，增加了前体丙酮酸的积累，过表达基因lpd、ilvD改善主路合成途径基因的表达情况，最终获得更高产D‑泛酸工程菌，无需质粒引入外源酶增强关键酶酶活，摇瓶发酵产量达到3.99g/L；敲除阻遏蛋白编码基因lacI后形成组成型表达，并进行培养基优化后，摇瓶发酵产量达到4.72g/L；在5L发酵罐中分批补料发酵，产量达到34.28g/L。

公开(公告)号：CN114350586A

公开(公告)日：2022-04-15

申请号：CN202210078039.X

申请日：2022-01-24

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  吴梓丹 ,  张博 ,  杨辉 ,  李世蓉 ,  王丽芳 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/54 ,  C12N15/62 ,  C12N15/31 ,  C12P13/12 ,  C12R1/19

摘要： 本发明涉及高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用。本发明改造了大肠杆菌的L‑半胱氨酸代谢途径与转运通道，通过利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将L‑半胱氨酸合成途径中的关键酶cysM、nrdH和cysE分别锚定到空间支架膜蛋白hflC、ybbK和hflK上，利用区室结构的优点，提升L‑半胱氨酸碳代谢重要中间产物O‑乙酰丝氨酸的积累，强化大肠杆菌L‑半胱氨酸硫代硫酸盐合成途径。同时过表达L‑半胱氨酸潜在的转运蛋白yeaS和alaE，进一步加强区室结构的优势，提高转运效率，得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸的产量从6.56g/L提高到了8.31g/L。

公开(公告)号：CN114350585A

公开(公告)日：2022-04-15

申请号：CN202210078036.6

申请日：2022-01-24

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  张博 ,  周俊平 ,  黄良刚 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/113 ,  C12N15/75 ,  C12N15/52 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N9/00 ,  C12N9/02 ,  C12N9/04 ,  C12N9/10 ,  C12N9/12 ,  C12P13/02 ,  C12R1/125

摘要： 本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)利用起始密码子TTG替换coaA基因原始起始密码子GTG的同时，敲除了coaX基因，弱化了D‑泛酸降解途径，减少了CoA的合成；(2)使用弱启动子PresD表达ilvE的同时，运用Cre/loxP基因编辑技术敲除了原有ilvK基因，在减少竞争支路代谢流的基础上进一步弱化了支链氨基酸合成途径代谢流；(3)运用Cre/loxP基因编辑技术敲除了poxB和lctE，为D‑泛酸合成提供了充分的代谢流。最后通过异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的panB及panC，强化了D‑泛酸合成途径中关键酶的表达，最终使得D‑泛酸产量相较于出发菌株从几乎检测不到提高到了67.4 g/L。

公开(公告)号：CN113832041A

公开(公告)日：2021-12-24

申请号：CN202111060498.7

申请日：2021-09-10

申请人： 浙江工业大学

发明人： 柳志强 ,  王浩南 ,  张博 ,  岑宇科 ,  翁春跃 ,  郑裕国

IPC分类号： C12N1/15 ,  C12N15/60 ,  C12N15/31 ,  C12N15/53 ,  C12N15/113 ,  C12N9/22 ,  C12N15/90 ,  C12P27/00 ,  C12R1/645

摘要： 本发明涉及一种高产赤霉素GA3的藤仓赤霉基因工程菌、构建方法及应用。本发明采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术敲除筛选标签的相关基因(pyrG)和代谢路径的调节基因(meaB)，并且过表达前体供应基因hmgR的催化基团编码序列thmgR，构建得到高产菌株F.fujikuroi RE:pyrG GpdA‑tHmgRΔmeaB，该菌株经过168h发酵培养基发酵后能积累2.35g/L的GA3产物。本发明提供了高产GA3的藤仓赤霉菌基因工程菌及构建方法，经过改造后的藤仓赤霉菌削弱了前体合成的反馈抑制，提高了代谢过程的前体供给，解除了GA3相关合成基因的转录抑制，相对于出发菌株能更高效的进行GA3的发酵生产，并且产量从2.0g/L提高到2.35g/L，为工程菌株的构建提供了可行的路线。